第3章 Bcl-2ファミリータンパク質によるプログラム細胞死の制御

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キーポイント

Bcl-2ファミリータンパク質は主に、ミトコンドリアの膜透過性を制御することによって、アポトーシスのon/offを決定している

Bcl-2ファミリータンパク質は、アポトーシス抑制型のBcl-2サブファミリーと、アポトーシス促進型のBaxサブファミリー、BH3-onlyタンパク質に大別され、お互いが直接間接に調節しあうことにより、ミトコンドリアの膜透過性が制御されている

アポトーシスの実行にはBaxサブファミリーの活性化が、原則として必要である

Bcl-2サブファミリーは、アポトーシスのみならず一部のネクローシスやオートファジー様細胞死をも調節しうる

はじめに

bcl-2遺伝子はヒト濾胞性リンパ腫のt(14;18)(q32;q21)転座点近傍に位置するがん遺伝子として1985年に辻本らにより発見された

1988年にVaux, 続いて辻本がBcl-2のアポトーシス抑制機能を報告して以来、多くののアポトーシスを誘導する系においてBcl-2の保護効果が報告されてきた

さらに、Bcl-2類似の構造を有する30以上のタンパク質が発見され、一群のファミリーを形成していることが明らかとなった

1. ミトコンドリアの膜透過性変化がアポトーシスのon/offを決定する

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アポトーシスは様々な刺激によって誘導されるが、各刺激によって活性化されたアポトーシスシグナルは、最終的にはほとんどすべての細胞死に共通のマシナリーに集約される

FasやTNFレセプターによる刺激の一部を除いて、多くの場合ミトコンドリアが集約される場となる

ミトコンドリアがアポトーシスの刺激を受けるとその膜透過性が亢進し、外膜と内幕により区画された膜間スペースに存在するシトクロムcやSmac/DIABLO, HtrA2/Omiなどのアポトーシス誘導タンパク質が細胞質に漏出する

漏出したシトクロムcは、ATP(もしくはdeoxy ATP)、Apaf-1と共同でイニシエーターカスパーゼ(caspase)であるcaspase-9を活性化する

活性型caspase-9はエフェクターカスパーゼであるcaspase-3(caspase-7)を活性化しアポトーシスが実行される

また、Smac/DiabloやHtrA2/Omiはカスパーゼ阻害タンパク質であるIAPファミリータンパク質の機能を抑制することによりアポトーシス実行に寄与する

Bcl-2ファミリータンパク質は主にミトコンドリアの膜透過性を制御し、これらアポトーシス誘導タンパク質の細胞質への漏出を調節することによってアポトーシスシグナルのon/offを決定している

2. Bcl-2ファミリータンパク質にはアポトーシスを抑制するものと促進するものがある

2-1. Bcl-2ファミリータンパク質の構造と分類

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Bcl-2ファミリータンパク質はその機能と構造から3つのグループに分類される

Bcl-2, Bcl-xLやMcl-1に代表されるアポトーシスを抑制するグループ(Bcl-2サブファミリー)

多くはBHドメイン(bcl-2-ホモロジードメイン)と呼ばれる特徴的なアミノ酸配列を4つ(BH1, BH2, BH3, BH4)すべて有している

また、C末端近傍に疎水性の高い領域(膜アンカードメイン)があり、ミトコンドリアなどのオルガネラ膜に局在するために必須

膜アンカードメイン

ミトコンドリアなどのオルガネラ膜や細胞膜に局在するために必要なアミノ酸領域

主に疎水性アミノ酸で構成されており、この部位のアミノ酸を欠如すると膜に局在しなくなる

Bcl-2ファミリータンパク質の膜アンカードメインはカルボキシ末端に存在し、この部分を欠損させると、タンパク質はその機能を失うことが知られている

BaxとBakに代表されるアポトーシスを促進するグループ(Baxサブファミリー)

BH4を除く3つのBHドメインを有する

また、C末端の疎水性領域を有している

BidやBimに代表されるアポトーシスを促進するグループ(BH3-onlyタンパク質)

このグループはBH3のみを有しているためBH3-onlyタンパク質と呼ばれる

C末端の疎水性領域を有しているメンバー(Bikなど)とそうでないメンバー(Bidなど)の両方がある

これら3つのグループのうち、BH3-onlyタンパク質はBcl-2サブファミリーやBaxサブファミリーの上流に位置し、これらの分子と直接結合することによって、その機能をそれぞれネガティブ、ポジティブに調節している

すなわち、上流のアポトーシスシグナルをミトコンドリアに伝えるシグナル伝達タンパク質として機能している

Baxサブファミリーはアポトーシス時のミトコンドリア膜透過性亢進に必須の分子として考えられている

Bcl-2サブファミリーはBaxサブファミリーやBH3-onlyタンパク質と直接結合し、これらを抑制的に調節している

このような諸反応の相対として、アポトーシス促進タンパク質の活性が抑制タンパク質の活性を凌駕した場合に膜透過性亢進が誘導され、アポトーシスが実行される

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2-1. BHドメインの機能

Bcl-2ファミリータンパク質の結合にはBHドメイン1~3が用いられる

すなわち、Bcl-2サブファミリーのBH1とBH2が受け皿様の構造をとり、BaxサブファミリーやBH3-onlyタンパク質のBH3がそこに結合するような構造をとっている

また、BH1とBH2はジフテリアトキシン類似のチャネルを形成する構造を呈しており、実際ににBcl-xLやBaxはチャネルタンパク質としての機能を有している

ただし、アポトーシス制御にこのチャネル機能がどの程度寄与しているかは不明

BH4ドメインはBcl-2サブファミリーに属する分子に特異的に存在しており、アポトーシス抑制に必須の領域

これは、BH4ドメインを欠損させた変異Bcl-2/Bcl-xLが抗アポトーシス活性を有さないこと、BH4ペプチド単独で抗アポトーシス活性を発揮しうることより明らか

またBH3ドメインはBH3-onlyタンパク質やBaxサブファミリーのアポトーシス誘導活性に必須の領域

3. BH3-onlyタンパク質はアポトーシス実行の引き金となる

BH3-onlyタンパク質には、他の2つのサブファミリーより多種類の分子が存在している

これはアポトーシス刺激の種類に応じて、種々の分子が使い分けられているためと考えられている

また、BH3-onlyタンパク質の多くは、正常状態ではミトコンドリアに局在しておらず、アポトーシス刺激に特異的な個々の制御を受けてミトコンドリアに集積する

例えば放射線や抗がん剤などのDNA傷害によるアポトーシスに際しては、p53依存的な転写を介してNoxa, Pumaなどが発現してミトコンドリアに集積する

Bimは正常細胞中でモーター分子であるダイニン複合体を形成するLC8鎖と結合して細胞質に存在しており、サイトカイン除去などの刺激により解離しミトコンドリアに集積する

ダイニン複合体

分子モーターの一つ

ダイニンはAAA(ATPase Associated with various cellular Activities)タンパク質であり、ATP加水分解による化学エネルギーを利用して微小管のマイナス端へ動くことにより、様々な物質輸送を担っている

また、カルシウム過負荷に際してはカルシニューリンを介してBadが脱リン酸化を受け、Fas/TNF刺激に際してはcaspase-8によりBidが切断され、それぞれ活性型となる

BH3-onlyタンパク質はBcl-2サブファミリーとBaxサブファミリーを直接の標的分子としている

しかしながら、BH3-onlyタンパク質とBcl-2サブファミリーとの結合は強く安定的に観察されるのに対し、Baxサブファミリーとの結合は観察されにくい

このため後者に関しては、一過性に結合し解離する(ヒットアンドラン)というモデルが提唱されている

また、BH3-onlyタンパク質の中でBcl-2サブファミリーに結合する分子(Bad, Bik)とBaxサブファミリー(Bid, Bim)に結合する分子に分類できるというモデルも提唱されている

いずれにせよ、Bax/Bak両ノックアウトマウス由来の線維芽細胞にBH3-onlyタンパク質を過剰発現しても細胞死は惹起されないことにより、BH3-onlyタンパク質が細胞死誘導機能を発揮するためにはBaxサブファミリーの存在が不可欠

BH3-onlyタンパク質のノックアウトマウスについては、Noxa, Puma, Bid, Bim, Bad, DP5などが作製されているが、その多くは表現型に異常は見られない

table:Bcl-2ファミリーのノックアウトマウスにおける異常の比較

Bcl-2 Bcl-x Bax/Bak Bim

寿命生後2~5週胎生13日周産期半数は胎生10日目で死亡

リンパ球異常減少減少増加増加

神経異常著明な異常はなし強いアポトーシス細胞増加正常

その他の異常多嚢胞腎, 腸管上皮脱落肝, 造血系の異常膣閉鎖, 水掻き自己免疫性腎炎, Bcl-2-/-マウスの異常を中和

その中において、唯一強い表現型を示すマウスは、Bimノックアウトマウス

このマウスは約半数が胎生致死(胎生10日目で死亡)であり、出生してきたマウスにおいては血球系、リンパ球系細胞が過剰に観察される

また、自己免疫性腎炎が観察されることから、Bimは主に血球、リンパ球系の生理的なアポトーシスに関与しているものと考えられる

実際、Bimノックアウトマウスのリンパ球は多くのアポトーシス刺激に抵抗性を示す

Bim以外のノックアウトマウスに関しても、表現型の異常こそ見られないものの、個別のアポトーシス刺激に対しては特異的な抵抗性を示す

例えば、PumaやNoxaをノックアウトしたマウスにおいては、特定の細胞におけるDNA傷害性アポトーシスが緩和される

またBidノックアウトマウスにおいてはFasを介したアポトーシスが誘導されにくい

これらの事実はBH3-onlyタンパク質が個々のアポトーシスの刺激特異性に機能していることを示すもの

4. Bax/Bakの活性化機構

BaxやBakの単独ノックアウトマウスは、表現型の異常がほとんどみられない

しかしながら、両者をノックアウトしたマウスは約90%が胎生致死(周産期に死亡)であり、生まれてきたマウスにおいてはリンパ節、胸腺、脾臓の腫大や過剰な神経細胞が観察される

また、Bax/Bak両ノックアウトマウスの胸腺細胞や胎仔線維芽細胞はミトコンドリアを経由する多くのアポトーシス刺激に対して、ほぼ完全に抵抗性を示す

これらの事実により、アポトーシス時のミトコンドリア膜透過性亢進(すなわちアポトーシス誘導)にはBax/Bakのいずれかの分子の活性化が必須であると考えられている

正常細胞中では、Baxは細胞質中に不活性型の単量体で存在しており、アポトーシス刺激によりミトコンドリアに移行し活性化(多量体化)する(ミトコンドリア移行と多量体化の順序は明らかではない)

この分子機構は十分明らかにされているわけではないが、我々は以下のことを報告している

①正常細胞におけるBaxは14-3-3タンパク質と結合することによって細胞質中に不活性型として留まっており、

②アポトーシスの刺激を受けると、14-3-3タンパク質はカスパーゼによる切断やJNKによるリン酸化などの修飾を受け、Baxとの解離が惹起される

③その結果、BaxはC末端の疎水領域が露出してミトコンドリア膜に移行し、BH3-onlyタンパク質の作用と相まって多量体(活性型)となる

同様なBax保持機能を有する分子としてKu70の関与も報告されている

一方、Baxは正常細胞中でミトコンドリア膜に不活性型(単量体)で存在している

ミトコンドリア外膜のチャネルタンパク質voltage-dependent anion channel-2(VDAC2)がBakの不活性化に寄与しているという報告がなされており、詳細な解析が望まれる

このように、ミトコンドリアの膜透過性亢進にはBax/Bakの多量体化が必要であると考えられるが、多量体化のみで十分であろうか？

この問題に関しては統一的な見解は形成されておらず以下に示す4つの節が提唱されている

①多量体化したBax/Bakのみによりミトコンドリア外膜にチャネルが形成され、そこをシトクロムcが通る

②Bax/Bakの四量体とcardiolipinなどのリン脂質によりチャネルが形成される

③Baxがミトコンドリア外膜のVDACチャネルと結合し、大きなチャネルを形成する

④permeability transition(PT)と呼ばれる特殊な膜透過性亢進現象が関与している

PTとはカルシウム存在下に、ミトコンドリアの膜電位低下(内膜透過性亢進)やシトクロムc漏出(外膜透過性亢進)が誘導される現象である

この現象は活性酸素などにより誘導され、免疫抑制剤であるサイクロスポリンA(CsA)によって阻害される特徴を有している

最近われわれは、サイクロスポリンA(シクロスポリンA, CsA)のミトコンドリア標的分子であるサイクロフィリンD(シクロフィリンD, CypD)がPT誘導に必須の構成分子であると考え、CypDのノックアウトマウスを作製した

その結果、見出したこと

①CypDノックアウトマウス由来のミトコンドリア(すなわちPTが起こらないミトコンドリア)においても、アポトーシス時の膜透過性亢進現象が正常に観察されること

②このマウス由来の胎仔線維芽細胞、胸腺細胞、肝細胞はいずれも正常にアポトーシスが誘導されること

これらの結果により、PTはBax/Bakが関与するミトコンドリア膜透過性亢進機構(すなわち、アポトーシス)には直接関与していないものと思われる

残りの3つの説のうち、いずれが正しいかは今後の検討が必要

われわれはVDACが何らかの形でBaxを介したアポトーシスに関与していることは間違いないものと考えている

①VDACノックアウト酵母のミトコンドリアでBaxの作用が見られないこと

②VDACの中和抗体をマイクロインジェクションした細胞でBaxの過剰発現や抗がん剤によるアポトーシスが回避されること

5. Bcl-2/Bcl-xLの多様な機能

5-1. アポトーシスの抑制

Bcl-2やBcl-xLを過剰発現した細胞は多くのアポトーシス刺激に対して強い抵抗性を示す

また、この際にミトコンドリア膜透過性亢進が観察されないことより、Bcl-2/Bcl-xLのアポトーシス抑制活性は、主にミトコンドリア膜透過性制御によっていると考えられている

Bcl-2/Bcl-xLのアポトーシス抑制機能は生理的にも観察されており、Bcl-2ノックアウトマウスではアポトーシスの亢進により発育不良、多嚢胞腎による腎不全、リンパ系組織や腸上皮の萎縮などの異常が観察される

また、Bcl-xのノックアウトマウスは胎生期に神経細胞や血球系の異常なアポトーシスで死亡する

また、Bax/Bak両ノックアウトマウスの表現型はBcl-2やBcl-xLのトランスジェニックマウスのそれらと類似していること、前述のBimノックアウトマウスとBcl-2ノックアウトマウスを交配して得られたBim+/-:Bcl-2-/-マウスやBim-/-マウスにおいてはBcl-2ノックアウトマウスの表現型がほとんど観察されなくなる(一方、Bimノックアウトマウスの表現型はおおむね維持されている)ことより、Bcl-2サブファミリーとBaxサブファミリー/BH3-onlyタンパク質がお互い抑制的に調節しあってアポトーシスを制御していることが伺える

5-2. 非アポトーシス細胞死の制御

一方、Bcl-2サブファミリーには以下のようなアポトーシス制御以外の機能も少なからず報告されており、その多くはBaxサブファミリーやBH3-onlyタンパク質とは独立に機能している

1. オートファジーあるいはオートファジー様細胞死を制御する

オートファジー(自食現象)は、細胞内成分をリソソームで分解するシステムであり、細胞構成成分を少しずつ分解することで合成と分解の平衡を保ち、細胞やオルガネラの新陳代謝に寄与している

最近われわれは、Bax/Bak両ノックアウト細胞(この細胞はアポトーシスは起こらない)にアポトーシス刺激を加えると、オートファジーマシナリーを使った細胞死が誘導されることを見出した

また、Bcl-2/Bcl-xLはオートファジー実行タンパク質であるBeclin 1を介して、この細胞死を調節していることも併せて明らかにした

→7. Bcl-2ファミリータンパク質は非アポトーシス細胞死も制御する

2. ミトコンドリアのpermeability transition(PT)を制御する

前述したミトコンドリアのPTは、BaxサブファミリーやBH3-onlyタンパク質による直接的な制御は受けないが、Bcl-2/Bcl-xLの過剰発現により部分的に抑制される

虚血性ネクローシスが、Bcl-2の過剰発現により一部抑制される事実が多数報告されているが、われわれはPTの制御を介した作用であると推察されている

→8. ネクローシスを制御するミトコンドリアの孔

3. ゲノムの突然変異率を上昇させる

Bcl-2/Bcl-xLはがん遺伝子の一つであるが、細胞死抑制機能以外にゲノムの突然変異率を上昇させることによりがん化に寄与している可能性が報告されている

4. 細胞周期の調節

Bcl-2/Bcl-xLを過剰発現した細胞では、細胞死抑制機能とは独立にG0からG1へのエントリーが遅れることが報告されている

メカニズムは明らかではないが、CDK2活性の調節やP27の発現上昇などがその原因の一つと考えられている

5. 小胞体(ER)でのカルシウム保持量を変える

ERのカルシウム調節チャネルタンパク質であるSERCAやIP3レセプターに直接結合し、ERで保持しているカルシウム量を低下させる

このカルシウムレベルの変化はストレス時の細胞質カルシウム量の低下に寄与し、ひいては細胞死を緩和させる

この系には、BaxサブファミリーやBH3-onlyタンパク質の関与も報告されている

6. その他

calcineurinやRaf-1などのタンパク質と直接結合し、これらの分子機能を調節している可能性も報告されている

これらの事実を勘案すると、Bcl-2サブファミリーはアポトーシスの制御を主な機能としながらも、一部のネクローシスやオートファジー様細胞死などの生理的な細胞死を幅広く調節していることがわかる

また、細胞死と分化、増殖はお互い巧妙に調節しあって発生やホメオスタシス(恒常性)の維持に寄与していると考えられているが、Bcl-2サブファミリーは細胞死のシグナルを分化や増殖のシグナルに伝達している可能性も考えられる

→第4章 p53によるアポトーシス制御のメカニズム